Ученые возлагают большие надежды на технологию CRISPR/Cas9, которая позволяет с высокой точностью вносить изменения в геномы живых организмов, включая людей. Публикуются все новые научные статьи, описывающие различные разновидности CRISPR-систем, а также их модификации. Рассказываем об открытиях в этой области, совершенных в 2016 году.

Тысячи их

CRISPR/Cas9 представляет собой систему адаптивного иммунитета бактерий, позволяющую микроорганизмам бороться с вирусами. Она состоит из спейсеров — участков ДНК, соответствующих определенным фрагментам (протоспейсерам) ДНК инфекционного агента. Спейсеры кодируют специфические молекулы crРНК, которые связываются с ферментом Cas9. Получившийся комплекс присоединяется к цепочке ДНК вируса, а Cas9 срабатывает как ножницы, перерезая ее.

На самом деле CRISPR/Cas9 — лишь одна из многих подобных систем, которыми располагают бактерии и археи. Ученые разделяют их на два класса. К первому классу относятся CRISPR-системы I, III и IV типов, ко второму — II и V. Тип II располагает белком Cas9, участвующим в приобретении новых спейсеров, накоплении crРНК в клетке и разрезании ДНК. В других системах для этих целей используются мультибелковые комплексы. Это делает тип II самым простым видом CRISPR-систем, подходящим для нужд генной инженерии.

Типы могут, в свою очередь, подразделяться на подтипы в зависимости от того, какие дополнительные гены связаны с CRISPR. Так, системы IIA содержат ген csn2, который кодирует белок, связывающийся с ДНК и участвующий в приобретении спейсеров. В системах IIB csn2 отсутствует, но зато есть ген cas4, чья функция пока неизвестна, а системы IIC не имеют ни csn2, ни cas4.

Сокровища внутри бактерий

Все известные CRISPR-системы обнаружены учеными в бактериях, выращенных в лабораторных условиях. Однако существует огромное количество некультивируемых микроорганизмов, к которым относятся как археи, так и бактерии. Они, как правило, обитают в экстремальных условиях — минеральных источниках или токсичных водоемах в заброшенных шахтах. Однако исследователи могут выделить из них ДНК и выявить в ней специфические участки. В новой работе, опубликованной в Nature 22 декабря, генетики из Калифорнийского университета в Беркли расшифровали геномы из естественных микробных сообществ, обнаружив другие разновидности CRISPR-системы.

Ученым удалось выяснить, что некоторые виды малоизученных археоподобных наноорганизмов ARMAN также обладают CRISPR/Cas9, хотя раньше считалось, что они есть только у бактерий. Отмечено, что эта система занимает промежуточное место между подтипами IIC и IIB и может служить защитой против паразитических «прыгающих» генов (транспозонов), попадающих в микроорганизм из других архей. Попытка воспроизвести активность архейной CRISPR/Cas9 в кишечной палочке (Escherichia coli) ни к чему не привела, что указывает на существование каких-то дополнительных специфичных механизмов, регулирующих систему.

Из бактерий, живущих в подземных водах и отложениях, были также выделены новые типы систем внутри второго класса — CRISPR/CasX и CRISPR/CasY. В систему CRISPR/CasX входят белки Cas1, Cas2, Cas4 и CasX. Последний, как показали эксперименты на E.coli, отличается нуклеазной активностью, то есть способен расщеплять чужеродную ДНК подобно Cas9. Однако происходит это только в том случае, если перед протоспейсерами находится последовательность TTCN, где N — любой из четырех нуклеотидов. Такие последовательности называются PAM (protospacer adjacent motif — мотив, смежный с протоспейсером). У системы CRISPR/Cas9 тоже есть своя PAM — NGG, которая должна располагаться после протоспейсера. Кроме того, CRISPR/CasY способна разрезать ДНК, если рядом с участком-мишенью имеется PAM-последовательность TA.

В чем перспективность этого открытия? Дело в том, что обнаруженные системы — самые компактные из известных на данный момент. По мнению ученых, небольшое количество необходимых для их работы белков делает CRISPR/CasX и CRISPR/CasY удобными инструментами для редактирования ДНК. Более того, метагеномные исследования, при которых изучается ДНК, полученная из окружающей среды, позволят открыть другие разновидности CRISPR-систем, полезные для генной инженерии.

Путь к совершенству

Конечно, поиску CRISPR-систем в природе есть альтернатива — усовершенствование уже существующей технологии CRISPR/Cas9. Несмотря на ее высокую точность, она совершает ошибки, разрезая ДНК не в том месте. Это мешает вносить правильные изменения в гены и, следовательно, эффективно лечить наследственные болезни. Поэтому ученые ищут способы улучшить работу системы. В 2016 году было выполнено много научных работ, посвященных модификации CRISPR и превращению ее в различные генные инструменты.

Так, 8 декабря в журнале Cell опубликована статья ученых из Торонтского университета, создавших «анти-CRISPR» — систему, выключающую механизм при определенных условиях. Это позволяет подавлять активность Cas9, если направляющая РНК свяжется не с тем фрагментом, и предотвращать ошибки. «Анти-CRISPR» состоит из трех белков, ингибирующих нуклеазу. Естественно, изначально она была изобретена не учеными, а вирусами, которые таким образом обезвреживали иммунитет бактерий.

В июне американские исследователи вместе с коллегами из России подтвердили, что система CRISPR/C2c2, полученная из фузобактерии Leptotrichia shahii, способна разрезать одноцепочечную РНК. В результате систему CRISPR можно применять для нокаутирования — подавления функций — матричной РНК, которая переносит информацию от генов в рибосомы, где на ее основе синтезируются белки.

В мае специалисты Калифорнийского университета создали технологию CRISPR-EZ, позволяющую вставлять в геномы эмбрионов мышей новые молекулы ДНК с почти стопроцентным успехом. Систему CRISPR/Cas9 вносят в оплодотворенные яйцеклетки животных с помощью микроскопической иглы и крохотного электрического разряда. В своем эксперименте ученым удалось внести мутацию в ген у 88 процентов мышей. Это превышает количество генномодифицированных мышей, полученных с помощью метода CRISPR-редактирования, в котором используются обычные инъекции.

В апреле, применив мутантный вариант Cas9, у которого отсутствует нуклеазная активность, молекулярные биологи из Медицинской школы при Массачусетском университете разработали технологию CRISPRainbow. В направляющей РНК, указывающей, куда прикрепиться ферментам, содержались флуоресцентные метки, что позволяет, например, отслеживать перемещение мобильных генетических элементов.

Ученые уже применяют CRISPR-системы для создания генетически модифицированных организмов, например, малярийных комаров, распространяющих среди своих диких сородичей вредные гены. Этот метод называется генным драйвом. Если один из родителей особи был носителем мутантного гена, то он передаст его своему потомку с 50-процентной вероятностью. Так происходит потому, что у родителя есть две копии гена, и только одна из них дефектная. CRISPR способна скопировать мутантный фрагмент и вставить его в здоровый ген. В результате потомки получают мутацию со 100-процентной вероятностью.

В 2016 году эксперты Консультативного комитета по рекомбинантной ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) одобрили заявку Пенсильванского университета на проведение испытаний по генетической модификации человека с помощью технологии CRISPR/Cas9.

Однако их обогнали китайцы. В ноябре журнал Nature сообщил, что ученые КНР впервые ввели в человека клетки с генами, модифицированными системой CRISPR/Cas9. Исследователи извлекли иммунные клетки (T-лимфоциты) из крови пациента, пораженного метастазирующим раком легких, а затем использовали CRISPR–технологию для отключения гена, кодирующего белок PD-1. Последний, как было показано, подавляет иммунитет, способствуя росту опухоли. Ученые культивировали отредактированные клетки, увеличив их количество, а затем ввели их обратно в организм человека. Справится ли генная терапия с болезнью, пока неизвестно.

CRISPR-системы также могут применяться для борьбы с ВИЧ и наследственными заболеваниями человека. Однако для разработки эффективных методов лечения требуются дальнейшие исследования. Конечно, речь не идет о мутантах, как в фантастических фильмах, однако ученые смогут достаточно быстро создавать генетически модифицированные организмы, например сельскохозяйственные растения с устойчивостью к паразитам. Остается гадать, почему ученые, открывшие CRISPR и сообразившие, как ее можно использовать, до сих пор не получили Нобелевскую премию.

Источник:lenta